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NK細胞活性檢測方法

點擊次數(shù):1987 更新時間:2016-01-04

    NK細胞是一種異質(zhì)性、多功能的細胞群,具有抗腫瘤、抗感染和免疫調(diào)節(jié)功能,并參與移植排斥反應(yīng)和某些自身免疫性疾病的發(fā)生,因而通過制備NK細胞克隆對其功能進行研究已受到人們的高度重視。測定人NK細胞活性多以K562細胞株作為靶細胞,而測小鼠NK細胞活性則用YAC細胞株,檢測方法多種多樣。

(一)形態(tài)法

    將效應(yīng)細胞與靶細胞按一定比例混合溫育,繼而用臺盼藍或伊紅Y等活細胞拒染的染料處理,然后分別計數(shù)著染的死細胞和不著染的活細胞,推算NK細胞活性。

1.材料

(1)靶細胞:K562細胞株或YAC細胞株。

(2)效應(yīng)細胞:NK細胞。

(3)含15%NCS的RPMI 1640培養(yǎng)液,5%臺盼藍染色液。

2.方法:

(1)效應(yīng)細胞的制備:將克隆的NK細胞用含15%NCS的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮,計數(shù)后調(diào)整細胞濃度至l×107/ml,備用。

(2)靶細胞的制備:取經(jīng)24h培養(yǎng)的靶細胞,用RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌1次,1000r/min離心6min。棄上清液,用:RPMI 1640培養(yǎng)液重懸后計數(shù),并用0.5%臺盼藍染色計數(shù),活細胞數(shù)達95%以上時可用作靶細胞。以RPMI l640培養(yǎng)液調(diào)整至1×105/ml,備用。

(3)效應(yīng)細胞靶細胞作用:用40孔培養(yǎng)板,對照組1~3孔,每孔加100μl靶細胞,再加入RPMI 1640培養(yǎng)液100μl;實驗組4~6孔,每孔加100gl靶細胞,再加入效應(yīng)細胞100μl,效應(yīng)細胞與靶細胞的比例為50:1。混勻,置5%CO2 37℃孵箱中培養(yǎng)過夜。

3.結(jié)果分析取m培養(yǎng)板,將細胞輕輕混勻成懸液,從每孔中取出30μl細胞懸液,加等量O.5%臺盼藍染液混合。室溫下5min后,計數(shù)白細胞數(shù)。對照組和實驗組每孔各計數(shù)100個細胞,分別記錄死亡細胞和活細胞數(shù),求出各組NK細胞活性的均值。

(二)酶釋放法

    將效應(yīng)細胞與靶細胞按一定比例混合溫育,離心沉淀,取上清液檢測靶細胞遭破壞后釋放出的酶含量。

(三)熒光法

    用熒光素標汜靶細胞,經(jīng)與效應(yīng)細胞共溫后,離心去上清液,用熒光計檢測剩余的活靶細胞的熒光。

(四)核素法

    將效應(yīng)細胞與靶細胞按一定比例混合共溫后,離心檢測上清液或剩余靶細胞放射性的量,間接反映其活性。有靶細胞胞漿釋放法和胞核釋放法兩種。

(五)化學發(fā)光法

    當效應(yīng)細胞與靶細胞接觸時,效應(yīng)細胞呼吸暴發(fā),生成極不穩(wěn)定的O 2-及OH一,放出光子,在發(fā)光劑存在條件下,可被光電倍增管接受和計數(shù),發(fā)光量與NK細胞殺傷能力相關(guān)。

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